HRP快速标记试剂盒使用前准备
一、标记前准备
1. 抗体预处理
o 透析或超滤去除抗体溶液中甘油、叠氮钠、Tris、甘氨酸、EDTA等干扰物（若存在），推荐使用0.01 M pH 7.4 PBS缓冲液透析。
o 调整抗体浓度至 2 mg/mL（常用范围2-10 mg/mL）。
o 小分子标记需确保HRP过量，标记后透析去除未结合分子。
2. 试剂盒准备
o 提前30分钟从2-8℃取出试剂盒，室温平衡。
o 按说明书操作使用。
二、标记步骤（以常见试剂盒为例）
方案A：快速标记法
1. 混合反应
o 抗体溶液中加入1/10体积标记缓冲液，混匀。
o 加入等质量的活化HRP（如1 mg抗体:1 mg HRP），吹打混匀避气泡1。
o 室温避光反应 60–120分钟。
2. 终止反应
o 每10 μL反应液加入1 μL终止液（如2.5 mg/mL硼氢化钠）。
o 室温避光静置30–60分钟。
方案B：高碘酸钠氧化法（传统）
1. HRP氧化
o 溶解NaIO₄（20 mg/mL），与HRP溶液等体积混合（如200 μL HRP + 200 μL NaIO₄）。
o 4℃避光反应30分钟（溶液变绿）。
2. 终止氧化
o 加入乙二醇溶液（4 μL乙二醇+40 μL水），4℃避光30分钟（溶液变褐）。
3. 交联抗体
o 将氧化HRP加入透析后的抗体中，4℃避光反应4小时。
4. 还原稳定
o 加入NaBH₄溶液（0.2 mg/mL），4℃反应1小时。
三、纯化与保存
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步骤 |
操作要求 |
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纯化 |
4℃ PBS透析过夜去除游离分子（或使用超滤/脱盐柱）；或采用酶标纯化剂（30分钟完成）。 |
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保存 |
加入等体积甘油，分装后 -20℃避光保存（避免反复冻融）。 |
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有效期 |
浓标记物可保存1–2年，稀释后需12小时内使用。 |
四、关键注意事项
1. 缓冲环境
o 标记反应需严格在说明书指定pH缓冲液（如pH 9.6碳酸盐或pH 7.4 PBS）中进行。
2. 避光操作
o HRP光照易失活，全程需避光。
3. 试剂新鲜度
o 终止液需现配现用，氧化剂NaIO₄避免分解。
4. 比例控制
o 抗体质量比通常为 1:1，需根据试剂盒说明调整。
不同试剂盒操作细节可能略有差异，具体请以产品说明书为准。